In situ hibridizācija

in situ hibridizācija ir hromosomu aberāciju noteikšanas metode. Dažas hromosomas ir marķētas ar fluorescējošām krāsvielām un piesaistītas DNS zondei. Šo paņēmienu izmanto gēnu mutāciju pirmsdzemdību diagnostikā.

Kas ir in situ hibridizācija?

In situ hibridizācijas vai Fluorescences in situ hibridizācija nukleīnskābes no RNS vai DNS tiek noteiktas noteiktos audos vai šūnās, izmantojot molekulārās ģenētiskās metodes. Parasti šāda veida diagnozi izmanto, lai grūtniecības laikā noteiktu strukturālu vai skaitlisku hromosomu anomāliju.

Šim nolūkam tiek izmantota mākslīgi ražota zonde, kas pati sastāv no nukleīnskābes. Pēc tam savienojas ar nukleīnskābēm organismā, izmantojot bāzu pārus. Šī saite ir domāta terminā hibridizācija. Pierādījumi balstās uz pacienta dzīves struktūru un tāpēc atbilst pierādījumiem in situ. Tas jānošķir no in vitro metodēm, kurās noteikšana notiek mēģenē. Metodi 20. gadsimtā izstrādāja zinātnieki Džo Galla un Marija Lu Pardue.

Kopš tā laika tehnoloģija ir attīstījusies. Kamēr toreiz tika izmantotas radioaktīvās zondes, piemēram, mūsdienās tiek izmantotas ar fluorescenci iezīmētas zondes ar kovalento saiti ar marķēšanas molekulām.

Funkcija, efekts un mērķi

In situ hibridizāciju parasti izmanto, lai noteiktu hromosomu aberācijas, t.i., hromosomu anomālijas, kuras nevar noteikt kariogrammā. Tas nozīmē, ka šo metodi vienmēr izmanto, ja grūtniecības laikā jānosaka iedzimtas slimības.

Tā kā hromosomu aberācijas ir problēma, kuru mūsdienās nevajadzētu novērtēt par zemu, metodes izmantošana laika gaitā ir palielinājusies. Hibridizācija notiek, balstoties uz vietējām šūnām no mātes amnija šķidruma. Tehnoloģijas pamatā ir ar krāsu marķētās zondes saistīšana ar DNS daļām. Pateicoties iesiešanai, eksemplāru skaitu vēlāk var noteikt ar mikroskopu, jo atsevišķās kopijas izstaro gaismas signālu un tādējādi tos var padarīt redzamus zem mikroskopa. Ir dažādas procedūras. Vai nu analīze notiek tūlīt pēc iesiešanas.

Šajā gadījumā tiek izmantota fluorescējoša krāsa, piemēram, biotīns, kas ir tieši piesaistīta DNS zondei. Izmantojot netiešo in situ hibridizācijas metodi, novērtēšanu nevar veikt tūlīt pēc hibridizācijas, jo fluorescējošās vielas var saistīties ar zondi tikai pēc hibridizācijas. Šo netiešo metodi izmanto biežāk nekā tiešo, jo tiek uzskatīts, ka tā ir jutīgāka. Papildus hromosomām specifiskiem centrometra DNS zondēm ir arī lokusam specifiskas DNS zondes, hromosomām specifiskas DNS bibliotēkas zondes un salīdzinošas genoma hibridizācijas.

Hromosomu skaitlisko anomāliju noteikšanai var izmantot hromosomām specifiskas centrometra DNS zondes. Tas nozīmē, ka tos galvenokārt izmanto gadījumos, kad ir aizdomas par hromosomu dublēšanos vai izdzēšanu. Vietai raksturīgās DNS zondes ir īpaši piemērotas minimālu mutāciju noteikšanai, kuras kariogrammā nevar noteikt. Injekciju un translokāciju noteikšanai īpaši izmanto hromosomām raksturīgu DNS bibliotēkas zondi.

No otras puses, salīdzinošā genoma hibridizācija ir visaptveroša hromosomu materiāla zaudējumu un ieguvumu analīze. Mūsdienās in situ hibridizācija ir ļoti svarīga dažādu hromosomu mutāciju diagnostikā.Dauna sindroma diagnozē zondes saistās, piemēram, ar 21. hromosomu.Šim nolūkam parasti tiek izmantotas hromosomām specifiskas zondes, kuras var izmantot, ja ir aizdomas par šo slimību.

Aizdomas var rasties, piemēram, ja vecāki iepriekš ir dzemdējuši bērnu ar šo slimību un ultraskaņas attēls ir neparasts. Ja divkāršās saites vietā ir trīskārša un tādējādi tiek izvadīts trīskāršs krāsu signāls, diagnozi uzskata par apstiprinātu.

Riski, blakusparādības un briesmas

Pretstatā, piemēram, PCR, in situ hibridizācija ir ievērojami mazāk jutīga pret piesārņojumu. Turklāt procesam nepieciešamais laiks ir ārkārtīgi mazāks. Tā kā embriji jo īpaši veido hromosomu shēmas, modeli nevar izmantot, lai droši noteiktu pārējo hromosomu sadalījumu un tādējādi citu šūnu ģenētisko stāvokli.

Krāsu signāli var arī pārklāties vai palikt neredzami citu iemeslu dēļ. Rezultātā in situ hibridizācija kā diagnostikas rīks ir diezgan pakļauts kļūdām grūtniecības laikā. Var rasties nepareizas diagnozes, un vecāki var izlemt par labu veselīgam embrijam. Lai samazinātu jutīgumu pret kļūdām in situ hibridizācijā, vienlaikus jāpārbauda vismaz divas embrionālās šūnas. Pārbaudot divas šūnas paralēli, tagad pastāv tikai nenozīmīgs nepareizas diagnozes risks.

Šādā gadījumā vecāki var pilnīgi paļauties uz diagnozi. In situ hibridizācija netiek piedāvāta katrai grūtniecei, bet tikai sievietēm no riska grupas. Neskatoties uz to, grūtniecēm šāda diagnoze netiek atteikta pēc viņu pašu pieprasījuma. Nenormāli ultraskaņas atklājumi vai patoloģisks serums var pamudināt ārstu piedāvāt diagnostikas procedūru. Lai arī lielu daļu, bet nekādā gadījumā ne visas, hromosomu aberācijas var diagnosticēt, izmantojot in situ hibridizāciju.

Tāpēc in situ hibridizāciju nekad nedrīkst veikt atsevišķi, tā vienmēr ir jāizmanto kopā ar parasto hromosomu testu. Šajā procedūrā liela loma ir grūtnieces aprūpei. Pirms analīzes notiek padziļināta diskusija ar topošo māti par diagnostikas metodi, kurā izskaidroti tehnoloģijas riski, iespējas un robežas.